Julkinen data -analyysi
Tiedot SARS-CoV-2-linjoista ja päivämäärä, jolloin näyte otettiin Chilestä saatavista sekvensseistä, saatiin Consorcio Genomas CoV2 -sivustolta, joka on saatavilla osoitteessa https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Rokotustiedot saatiin tiede-, teknologia-, tieto- ja innovaatioministeriön julkisista tiedoista, jotka ovat saatavilla osoitteessa https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (Tuote 83).
Tartuntamääritys
Pseudotyyppisiä viruksia, jotka kuljettivat erilaisia SARS-CoV-2-piikkiproteiineja, valmistettiin edellä kuvatulla tavalla12. Lyhyesti sanottuna, HIV-1-pohjaisia SARS-CoV-2 -pseudotyyppejä tuotettiin HEK293T-soluissa transfektoimalla pNL4.3-ΔEnv-Luc yhdessä vastaavan pCDNA-SARS-CoV-2 Spike-koodausvektorin kanssa moolisuhteessa 1: 1. Plasmidit, jotka koodaavat kodonille optimoidun piikin, josta puuttuu C-terminaalisen pään (SΔ19) viimeiset 19 aminohappoa, joiden tiedetään välttävän retentiota endoplasmisessa verkkokalvossa12 saatiin geenisynteesillä tai mukautetulla kohdekohtaisella mutageneesillä (GeneScript) ja ne sisälsivät seuraavat mutaatiot: linja A (vertailusekvenssi), linja B (D614G), linja B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), linja P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I) ja linja C.37 (G75V, T76I, 246, L252Q, F452S, D490G, T614N). Jokainen pseudotyyppivalmiste puhdistettiin sentrifugoimalla nopeudella 859 rpm huoneenlämpötilassa, kvantifioitiin käyttämällä HIV-3,000 Gag p1 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems) -järjestelmää, jaettiin 24% naudan sikiön seerumiin (Sigma-Aldrich) ja säilytettiin -50 ° C: ssa käyttää. Eri määriä pseudotyyppisiä viruksia (määritettynä HIV-80 p1 -proteiinin pitoisuuksilla) käytettiin HEK-ACE24-solujen tartuttamiseen ja 2 tuntia myöhemmin tulikärpän lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttäen lusiferaasimääritysreagenssia (Promega) Glomax 48 -levyllä luminometri (Promega).
Neutralointimääritys
Pseudotyyppiset viruksen neutralointimääritykset suoritettiin olennaisesti kuten aiemmin kuvattiin12. Lyhyesti, plasmanäytteiden sarjalaimennokset (1: 4 - 1: 8748) valmistettiin DMEM: ssä, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia, ja inkuboitiin 5 ng: n p24: n kanssa jokaista pseudotyyppistä virusta 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja sitten 1 x 104 kuhunkin kuoppaan lisättiin HEK-ACE2-soluja. Negatiivisena kontrollina käytettiin HEK293T -soluja (jotka eivät ekspressoi ACE2: ta) pseudotyyppisen viruksen (linja A) kanssa. Solut hajotettiin 48 tuntia myöhemmin, ja Firefly -lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttäen lusiferaasimääritysreagenssia (Promega) Glomax 96 Microplate -luminometrissä (Promega). Kunkin laimennoksen neutraloitumisprosentti laskettiin ja kunkin näytteen ID50 laskettiin käyttämällä GraphPad Prism -versiota 9.0.1.
Tilastolliset analyysit
Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen GraphPad Prism -ohjelmiston versiota 9.1.2. Useita ryhmävertailuja neutraloivien vasta-ainetiitterien (NAbT) vastaan SARS-CoV-2-pseudotyyppisten virusten paneelia vastaan sekä NAb-vasteiden vertailua sukupuolen ja savun tilan mukaan suoritettiin käyttämällä pariksi yhdistettyä Wilcoxonin allekirjoitettua testiä. Kerroinmuutos laskettiin ID: n geometrisen keskiarvon tiitterin erona50 verrattuna villityypin pseudotyyppiseen virukseen. Korrelaatioanalyysi NAbT: n ja iän tai BMI: n välillä suoritettiin käyttäen Spearmanin testiä. Yksisuuntainen ANOVA ja Tukeyn moninkertainen vertailutesti suoritettiin tarttuvuuden tilastollista analyysiä varten. P -arvoa ≤0.05 pidettiin tilastollisesti merkitsevänä.
Eettinen hyväksyntä
Tutkimuspöytäkirjan hyväksyivät Universidad de Chilen lääketieteellisen tiedekunnan eettinen komitea (projektit nro 0361-2021 ja nro 096-2020) ja Clínica Santa Maria (hanke nro 132604-21). Kaikki luovuttajat allekirjoittivat tietoisen suostumuksensa, ja heidän näytteensä anonymisoitiin.
Lambda -variantin piikkimutaatioiden vaikutus tarttuvuuteen ja neutraloiviin vasta -ainevasteisiin
Analyysi 3695 Chilen sekvenssistä, jotka on talletettu GISAID: ään 24. kesäkuutath Vuonna 2021 SARS-CoV-2-variantit Gamma ja Lambda ovat selvästi hallitsevia viimeisen kolmanneksen aikana, yhteensä 79% kaikista sekvensseistä.
Mielenkiintoista on, että tälle ajanjaksolle on ollut ominaista massiivinen rokotuskampanja, jossa 65.6% kohdepopulaatiosta (18 -vuotiaat ja sitä vanhemmat) on saanut täydellisen rokotusohjelman 27. kesäkuutath 2021
Ottaen huomioon, että 78.2% ihmisistä, jotka on rokotettu täydellisellä järjestelmällä, saivat inaktivoidun CoronaVac -rokotteen Sinovac Biotechiltä, pyrimme tutkimaan Lambda -variantissa esiintyvien piikkimutaatioiden vaikutusta tämän rokotteen aiheuttamiin vasta -aineiden neutralointikykyyn.
Tätä varten loimme HIV-1-pohjaisia pseudotyyppisiä SARS-CoV-2-viruksia, jotka kantoivat piikkiproteiinia Wuhan-1-vertailulinjasta (villityyppi; linja A), D614G-mutaatiosta (linja B) ja alfa (linja B) .1.1.7), gamma (linja P.1) ja lambda (linja C.37).
Viruksen valmistelun aikana havaitsimme johdonmukaisesti, että Lambda -piikkiä kantavalla pseudotyyppisellä viruksella infektoituneet solut tuottivat merkittävästi korkeampia bioluminesenssiarvoja verrattuna D614G -mutanttiin tai alfa- ja gamma -variantteihin, mikä osoittaa Lambda -piikkiproteiinin aiheuttamaa lisääntynyttä tarttuvuutta
Kuva 1.Eri piikkiproteiinien välittämä tartunta.
(A) Kaavamainen esitys SARS-CoV-2-piikkiproteiinista ja tässä tutkimuksessa käytetyistä muunnelmista. Sukulinjat ilmoitetaan suluissa. RBD, reseptoria sitova domeeni, CM; sytoplasminen häntä.
(B) Kunkin sukulinjan pseudotyyppien titraaminen käyttäen vastaavia määriä HIV-1 p24: tä. Firefly-lusiferaasiaktiivisuus mitattiin suhteellisina luminesenssiyksiköinä (RLU) 48 tuntia infektion jälkeen. Keskiarvo ja SD laskettiin edustavasta kolminkertaisesta kokeesta.
Seuraavaksi käytimme edellä mainittuja pseudotyyppisiä viruksia neutralointimääritysten tekemiseen käyttäen 79 plasmanäytettä terveiltä terveydenhuollon työntekijöiltä Universidad de Chilestä ja Clínica Santa Maríasta Santiagossa, Chilessä.
Poistimme pois 4 näytettä, koska emme pystyneet laskemaan ID50 -tiitteriä. Analysoiduista näytteistä 73% vastasi naisia, mediaani -ikä 34 vuotta (IQR 29-43) ja kehon maksimi -indeksi (BMI) 25 (IQR 22.7-27). 20.5% osallistujista ilmoitti olevansa aktiivisia tupakoitsijoita immunisaatiokauden aikana. Näytteet otettiin keskimäärin 95 päivän (IQR 76-96) jälkeen CoronaVac -rokotteen toisen annoksen jälkeen
Havaitsimme, että villityypin piikkiproteiinia kantavan pseudotyyppisen viruksen neutralointi johti 50%: n estävään laimennukseen (ID50) keskimääräinen tiitteri 191.46 (154.9 - 227.95, 95%: n luottamusväli), kun se oli 153.92 (115.68 - 192.16, 95%: n luottamusväli), 124.73 (86.2 - 163.2, 95%: n luottamusväli), 104.57 (75.02 - 134.11, 95%: n luottamusväli) ) ja 78.75 (49.8 - 107.6, 95%: n luottamusväli) pseudotyyppisille viruksille, jotka kuljettavat piikkiproteiinia D614G -mutantista tai vastaavasti alfa-, gamma- ja lambda -variantista.
Havaitsimme myös, että ID: n geometrinen keskimääräinen tiitteri50 titterit laskivat kertoimella 3.05 (2.57 - 3.61, 95% CI) Lambda -piikkiä kantavalla pseudotyyppisellä viruksella, 2.33 (1.95 - 2.80, 95% CI) gammapiikillä, 2.03 (1.71 - 2.41, 95% CI) Alpha -piikille ja 1.37 (1.20 - 1.55, 95% CI) D614G -piikille verrattuna Wild -tyyppiseen piikkiin.
Tutkimuskohortissamme ei havaittu korrelaatiota sukupuolen, iän, painoindeksin (BMI) tai savun tilan ja neutraloivien vasta-ainetiitterien välillä.
Kuva 2.Neutralointimääritys käyttäen CoronaVac -rokotettujen plasmanäytteitä
(A) Muutokset vastavuoroisessa 50% neutralointitiitterissä (ID50) plasmanäytteissä 75 vastaanottajalta CoronaVac -rokotetta vastaan D614G (linja B), alfa (linja B.1.1.7),
Gamma (linja P.1) ja Lambda (linja C.37) variantit verrattuna villityypin virukseen. Tulokset esitetään erotuksena sovitettujen näytteiden neutralointitiittereissä. P -arvot tunnuksen vertailuun50 lasketaan Wilcoxonin allekirjoitetulla rank-testillä.
(B) Laatikkokaaviot osoittivat ID: n mediaanin ja neljännesvälin alueen (IQR)50 jokaiselle pseudotyyppiselle virukselle. Kerroinmuutokset näytetään ID: n geometrisen keskiarvon tiitterin erona50 verrattuna villityypin pseudotyyppisen viruksen viruksiin. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Wilcoxonin sovitetun parin allekirjoitettu-rank-testiä.
Yhdessä tietomme paljastivat, että hiljattain tunnetun kiinnostuksen kohteena olevan Lambda -variantin piikkiproteiini, joka kiertää voimakkaasti Chilessä ja Etelä -Amerikan maissa, sisältää mutaatioita, jotka lisäävät tarttuvuutta ja kykyä paeta CoronaVacin aiheuttamia neutraloivia vasta -aineita.
MITÄ TÄSTÄ ARTIKKELASTA OTTAA POIS:
- An analysis of 3695 sequences from Chile deposited at GISAID as per June 24th 2021 shows a clear dominance of the SARS-CoV-2 variants Gamma and Lambda during the last trimester accounting, together, for the 79% of all sequences.
- Different amounts of pseudotyped viruses (as determined by the levels of the HIV-1 p24 protein) were used to infect HEK-ACE2 cells and 48 hours later, firefly luciferase activity was measured using the Luciferase Assay Reagent (Promega) in a Glomax 96 Microplate luminometer (Promega).
- 2% of the people inoculated with a complete scheme received the inactivated virus vaccine CoronaVac from Sinovac Biotech, we sought to investigate the impact of the spike mutations present in the Lambda variant on the neutralizing capacity of antibodies elicited by this vaccine.
